實時定量PCR的原理、探測化學(xué)物質(zhì)及探針優(yōu)化

                         上?；偕镪U述實時定量PCR的原理及探測化學(xué)物質(zhì)

 

實時定量PCR原理

    對擴增產(chǎn)物進行可重復(fù)性的定量長期以來一直是科學(xué)家和研究者的目標(biāo)。傳統(tǒng)的方法需要對終產(chǎn)物進行凝膠電泳分析。這種方法可以確定目的產(chǎn)物和競爭產(chǎn)物的大小，估算純度，計算條帶強度。然而，所用擴增試劑和體系的變動會造成擴增的終產(chǎn)物的重復(fù)性有較大的變動，成為這種方法的主要弊端。擴增過程的指數(shù)期提供給我們zui有用的，可重復(fù)的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過程的指數(shù)期的擴增產(chǎn)物量之間存在著定量關(guān)系。這正是實時擴增的基礎(chǔ)。隨著DNA內(nèi)嵌染料和探針特異性化學(xué)的發(fā)展，實時探測量子學(xué)的跳躍發(fā)展推動了對擴增過程的研究進展。

    今天的實時設(shè)備由熒光讀數(shù)計和熱循環(huán)儀組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。在擴增的每個循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來進行擴增的實時監(jiān)控。用戶能夠根據(jù)一個一個的循環(huán)知道那個樣品正在擴增。這些即時的數(shù)據(jù)允許用戶看清楚各個樣本相對于標(biāo)準(zhǔn)品，陽性對照和陰性對照是如何擴增的。用戶不僅能在擴增過程中監(jiān)督整個反應(yīng)，還可以根據(jù)反饋的信息來優(yōu)化相應(yīng)程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。

    正?；蟮臄?shù)據(jù)畫成熒光值相對于循環(huán)數(shù)的對數(shù)圖。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴增效率為zui大，這樣可以獲得zui準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時擴增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。


探測化學(xué)物質(zhì)

有5種主要類型的探測化學(xué)物質(zhì)用于實時擴增，包括： 
1 內(nèi)嵌染料 
2 雙標(biāo)記探針 
3 FRET探針 
4 分子信標(biāo) 
5 Ampliflor

1內(nèi)嵌染料（Sybr-Green I ）

內(nèi)嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與雙鏈DNA結(jié)合 
a） SG不與單鏈DNA結(jié)合，熒光信號強度較低 
b） SG與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號強度極大的增強

SG是一種熒光染料，能結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態(tài)的未結(jié)合染料顯示低的熒光強度，一旦結(jié)合到雙鏈DNA之后熒光信號增強。這種特性被利用在實時擴增中。由于在擴增反應(yīng)中DNA增加，染料結(jié)合到擴增產(chǎn)物上，熒光信號增強。熒光信號相對背景水平的增加進行分析。根據(jù)擴增子的長度有多個熒光染料的分子結(jié)合到雙鏈DNA上。內(nèi)嵌染料可以所有其他傳統(tǒng)擴增成分，例如水，緩沖液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴增反應(yīng)管中。因為不需要設(shè)計序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便 ，性價比較高的實時監(jiān)測方法。

內(nèi)嵌染料沒有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特異產(chǎn)物和引物二聚體在內(nèi)的任何dsDNA上，因此有必要區(qū)分目標(biāo)信號和假信號。內(nèi)嵌染料可以在反應(yīng)末尾對擴增產(chǎn)物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，實時儀器連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。


溶解峰反映了反應(yīng)中擴增到的產(chǎn)物。這些峰是凝膠電泳中條帶的類似物。因此，用溶解曲線數(shù)據(jù)對SG反應(yīng)后的產(chǎn)物進行質(zhì)量監(jiān)督。

2 雙標(biāo)記探針

雙標(biāo)記探針是一種短的寡核苷酸序列，5‘末端連接有熒光報告染料，3‘端連接有熒光淬滅分子。由于這種探針只有15-25bp長，報告基團和淬滅基團緊密接近，幾乎探測不到熒光信號。在循環(huán)過程中，Taq DNA聚合酶對每個引物進行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸過程中會切除下游的探針。一旦探針被降解，報告染料就會與淬滅分子相分離。 
a） 報告染料R發(fā)射的能量被淬滅分子Q所吸收和淬滅。 
b） 聚合酶的外切核酸酶活性通過水解方式將報告染料與淬滅分子相分離導(dǎo)致了熒光信號的增加。

在每個擴增循環(huán)由于切開了探針因此實時設(shè)備探測到報告染料的增加。由于報告染料被切開，因此不能進行溶解曲線分析。雙標(biāo)記探針比內(nèi)嵌染料有更高的特異性，這里有2個原因 ：
  首先，雙標(biāo)記探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補區(qū)。

  第二個原因是雙標(biāo)記探針對每擴增的一個拷貝只釋放一個分子的熒光染料。由于雙標(biāo)記探針增加了特異性，這種探測方法很適合檢測低拷貝數(shù)的模板。


3．FRET 探針

FRET 
探針依靠熒光能量從一個熒光染料到另一個的傳遞。兩個獨立的特異寡核苷酸序列都標(biāo)記上熒光基團。上游探針在3‘末端有一個供體基團，下游探針在5‘末有一受體基團。設(shè)計探針時他們在與目標(biāo)序列結(jié)合時互相臨近，使供體和受體熒光基團緊密接近。一旦探針雜交到模板上，從供體到受體熒光基團的能量傳遞產(chǎn)生了一個不同波長的熒光信號。供體熒光信號的減弱和受體熒光信號的加強都能分別監(jiān)測到。因此，只有當(dāng)兩個探針都結(jié)合上去才能檢測到熒光信號。FRET 
探針可以進行溶解曲線分析，對基因型分析，SNP檢測和其他突變檢測非常有用。

a） 擴增循環(huán)中，兩個探針與靶DNA退火 
b） 供體被外部光源激發(fā)通過能量傳遞導(dǎo)致發(fā)射熒光的產(chǎn)生。

4 分子信標(biāo)

第四種檢測方法是分子信標(biāo)（MB）。這種探針的基本特征是有一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)的一個末端有一個熒光染料報告基團，在另一個末端有一個淬滅分子。 
這個發(fā)夾結(jié)構(gòu)能使MB探針在不雜交時保持折疊狀態(tài)，報告基團和淬滅分子處于接近的距離，幾乎沒有熒光信號發(fā)出。然而，當(dāng)MB與模板雜交時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)色團不會被淬滅。在這個時間點，實時儀器能探測到熒光信號。用MB探針也可以進行溶解曲線分析。

a） 分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)淬滅了熒光信號 
b） 雜交后開始發(fā)射熒光信號

得益于實時探測技術(shù)的實際應(yīng)用數(shù)量和應(yīng)用類型影響深遠(yuǎn)。其中的一些益處包括有機體的鑒定，診斷性檢測，基因表達研究，突變檢測，SNP檢測，基因型和微陣列結(jié)果確證等。每種不同的化學(xué)物質(zhì)根據(jù)應(yīng)用的不同會提供給用戶不同的便利。應(yīng)該注意的是，得益于實時測技術(shù)并建立在熒光化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)上的還有其他檢測核酸的等溫擴增系統(tǒng)。

5 AmplifluorTM直直接基因系統(tǒng)

AmplifluorTM直直接基因系統(tǒng)基本特征是激發(fā)的熒光進行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。目標(biāo)特異性AmplifluorTM直引物包含一個5‘內(nèi)部互補序列，標(biāo)記有熒光發(fā)色（fluorescerin）和一個能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3‘端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的AmplifluorTM直引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。

在*個循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的*條鏈退火并被Taq酶延伸。在 第二個循環(huán)中 
Amplifluor引物1延伸產(chǎn)物作為引物2（反義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號。隨后的擴增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的增強與擴增產(chǎn)物量的增加成比例。