簡述腺病毒包裝

腺病毒概述

    腺病毒（Adenovirus，AdV）是一種無包膜的線性雙鏈DNA病毒，基因組長約35000 bp，理論上可編碼22~40個基因，兩端各有長約100~150bp的末端反向重復(fù)序列（ITR），在其左端ITR3，端為長約300bp的包裝信號（Ψ）。病毒顆粒直徑約80~110 nm，病毒衣殼有252個殼粒，呈規(guī)則的正二十面體面體結(jié)構(gòu)，其中包括240個六聯(lián)體和12個位于正二十面體頂部的五聯(lián)體構(gòu)成。

    腺病毒是一種非整合型雙鏈DNA病毒，在自然界中廣泛分布。盡管一些類型的腺病毒會引起人胃腸道、呼吸系統(tǒng)或眼部的急性感染，但是應(yīng)用于基因治療研究的腺病毒是安全的，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害。

    利用基因工程手段將腺病毒基因組DNA改造成多種基因操作表達(dá)載體，目前常用的腺病毒包裝系統(tǒng)有：AdMax系統(tǒng)和AdEasyTM系統(tǒng)。

 

AdEasyTM包裝系統(tǒng) 

    AdEasyTM 包裝系統(tǒng)主要的特點(diǎn)是利用Cre/loxP系統(tǒng)在大腸桿菌（BJ5183）中完成外源基因插入腺病毒基因組的過程，獲得環(huán)狀的重組腺病毒基因組，并且具有在細(xì)菌中復(fù)制的必需元件。將重組腺病毒基因組酶切線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，避免了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染得到重組腺病毒。

使用這個系統(tǒng)需要注意以下問題： 

（1） 要用能表達(dá)Cre重組酶的特定的大腸桿菌，建議建立菌種庫以免細(xì)菌發(fā)生變化；

（2） 由于重組是在細(xì)菌中發(fā)生的，微小的基因組變化不易發(fā)現(xiàn)； 

（3） 要獲得高品質(zhì)的重組腺病毒毒種（高病毒產(chǎn)量、高目的基因表達(dá)）應(yīng)挑選多個重組腺病毒質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得多個重組病毒來篩選。

 

AdMax包裝系統(tǒng) 

    AdMax包裝系統(tǒng)是通過Cre/loxP 獲得重組病毒，這個過程發(fā)生在HEK293細(xì)胞中，從而避免在細(xì)菌中重組。將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。這個系統(tǒng)有多種優(yōu)勢，包括操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率高、目的基因的表達(dá)水平高（因?yàn)閙CMV啟動子比hCMV啟動子強(qiáng)若干倍）等。 

    與AdEasy系統(tǒng)相比，AdMax系統(tǒng)有一定的優(yōu)勢：只需要3~4周就能完成從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核細(xì)胞內(nèi)重組出毒，保持了對腺病毒的生存壓力，有助于重組腺病毒的基因組的完整性；而AdEasy系統(tǒng)的出毒成功率只有18~34%（Stratagene公司新版的AdEasy XL系統(tǒng)成功率在94%左右），且在細(xì)菌（BJ5183）中完成病毒基因組重組，理論上，失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發(fā)生突變，病毒遺傳背景及活性可能會受到影響。

 

腺病毒載體有下列優(yōu)點(diǎn)：

1、腺病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能研究的比較清楚；

2、可裝入基因的容量較大（8K）；

3、轉(zhuǎn)染范圍廣，轉(zhuǎn)染率較高，所有腺病毒載體均有轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞的能力；

4、不整合到靶細(xì)胞基因組，無插入突變，無致癌性，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害；

5、可以復(fù)制出滴度高（可以達(dá)到1011 pfu/mL）、穩(wěn)定性好、基因轉(zhuǎn)移效率高的病毒；

6、適用于在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行的RNA干擾、過表達(dá)特定基因或過表達(dá)特定microRNA研究和In Vivo實(shí)驗(yàn)。 

 

腺病毒包裝

    重組腺病毒包裝是以Ad5血清型E1／E3缺陷型腺病毒DNA為架，在克隆，包裝，擴(kuò)增等各部條件做了改進(jìn)和優(yōu)化，達(dá)到了克隆陽性率更高，質(zhì)量更可靠，包裝穩(wěn)定，出毒迅速，滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上，還拓展了更廣泛的應(yīng)用，可以提供各種帶報告基因的，帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。 

    所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位，Co-IP，干細(xì)胞研究等科研實(shí)驗(yàn)。并且可以完成較高難度的克隆構(gòu)建，包括具有細(xì)胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建，在短時間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的構(gòu)建工作。

服務(wù)簡介：

提供各種RNA干擾和基因過表達(dá)的腺病毒包裝服務(wù)。

服務(wù)內(nèi)容：

    是以帶熒光或不帶熒光的pEC3.1（+）為穿梭載體，pAd/BL-Dest為骨架載體進(jìn)行的過表達(dá)病毒包裝；以pGensil為穿梭載體，pAd/BL-Dest為骨架載體進(jìn)行干擾病毒的包裝。