熒光定量PCR的原理、方法及結(jié)果分析

　　熒光定量PCR的原理、方法及結(jié)果分析
　　自K. Mullis發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術(shù)很快成為科研、臨床診斷的熱點(diǎn)技術(shù)。RT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)）就是在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號(hào)的變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR的反應(yīng)過程，通過對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目前，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 已成為不同樣品間進(jìn)行基因表達(dá)水平定量差異比較的權(quán)威性方法。在過去十幾年中，該方法迅速流行，涉及科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，包括農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究。
　　目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、動(dòng)物疫病檢測(cè)等，除此之外，還包括：
　　● 基因擴(kuò)增
　　● 擴(kuò)增特異性分析
　　● 基因定量分析
　　● 基因檢測(cè)
　　● 基因分型
　　● SNP分析
　　● RFLP多態(tài)性分析
　　● 單/多基因表達(dá)研究
　　● 高通量基因表達(dá)譜研究
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　　（1）染料法
　　熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個(gè)循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時(shí)，其缺點(diǎn)也在于其非特異性。當(dāng)PCR反應(yīng)中有引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增時(shí)，該染料也可以和這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對(duì)特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。
　　常用的染料為SYBR Green I，各公司針對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度、抑制作用等進(jìn)行改進(jìn)，也推出了很多新的染料供大家選擇。
　　Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye，對(duì)qPCR反應(yīng)沒有抑制作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號(hào)更強(qiáng).
　?。?）探針法
　　在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。
　?。?）熒光定量
　　一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法計(jì)算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了幾個(gè)重要的概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CT值。
　　注：
　　橫坐標(biāo)：代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù);
　　縱坐標(biāo)：代表熒光強(qiáng)度，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)收集。
　　熒光閾值(Threshold)
　　在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。(如下圖)
　　每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時(shí)，對(duì)于熒光PCR實(shí)驗(yàn)來說，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標(biāo)。(如下圖)
　　實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用
　　PCR檢測(cè)方法在臨床醫(yī)學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR方法就可以檢測(cè)到。該方法對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問題，常用于疾病的早期診斷，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。
　　大量的熒光定量PCR研究資料表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。因此，通過熒光定量PCR方法得到的檢測(cè)結(jié)果，一定程度上可以準(zhǔn)確反映疾病感染的情況。
　　除此之外，也可以見于腫瘤分子機(jī)制、遺傳病篩查、樣本成分鑒定等多方面的實(shí)際應(yīng)用中。